Ученые получили изображения мозга мыши с помощью фемтосекундного лазера и используя гораздо более слабый лазер, но с применением нового красителя. Техника получения изображений, основанная на красителях и известная как двухфотонная микроскопия, может воспроизводить на фото активные нервные структуры, подробнее, чем магнитно-резонансная томография, или МРТ, но она требует мощных и дорогих лазеров.
Теперь же группа исследователей из Университета штата Пенсильвания разработала новый вид красителя, использование которого позволяет снизить стоимость применяемого оборудования в десятки раз.
Исследование проводилось под руководством доцента Сергея Виноградова и докторанта Татьяны Есиповой, оба сотрудники кафедры биохимии и молекулярной биофизики в Пенсильванской Школе медицины Перельмана, совместно с Кристофером Мюрреем (Christopher Murray), профессором Отдела химии в Школе искусств и наук и материаловедения и инженерии в Школе инженерии и прикладных наук.
Отчет об их работе был опубликован в «Трудах Национальной академии наук».
Метод двухфотонной микроскопии заключается в использовании мощного лазера, посылающего сильно сфокусированный пучок фотонов, которые могут пройти через живые ткани. При этом используется энергия пары инфракрасных фотонов, которые сталкиваются с молекулой маркерного красителя и заставляют его флуоресцировать в видимой части спектра.
При сканировании сфокусированным пучком объемного пространства, флуоресценция красителя может выявить даже мельчайшие 3D структуры, такие как капилляры в мозге и даже отдельные клетки. Используя красители чувствительные к химии специфических биологических процессов, происходящих в мозге, таких как движение ионов кальция, которые позволяют возбуждать нейроны, данный метод может использоваться даже для функциональной визуализации, то есть наблюдения изменения в активности нейронов в процессе того, как субъект думает.
“Это практически единственный способ чтобы увидеть отдельные клетки или даже объекты субклеточного уровня в мозге, – сказал Сергей Виноградов. – МРТ позволяет наблюдать только больше регионы, но вы не видите деталей, а многое из того, что нас интересует, находится очень близко друг к другу”.
Недостаток двухфотонного метода заключается в том, что используемые в настоящее время красители требуют огромного количества энергии для получения видимых изображений. Исследователи должны использовать фемтосекундные лазеры, способные излучать квадриллионы пар фотонов в секунду. Эти лазеры очень дорогие, и это ограничивает их применение в микроскопии.
Одним из возможных решений могло бы быть использование красителей, которые флуоресцируют более легко. С этой целью давно проводились исследования наночастиц из лантанидов в качестве молекулярных зондов.
“Эти наночастицы имеют возбудимость, которая в 10 миллионов раз выше, чем существующие молекулярные красители, – сказал Виноградов. – А это означает, что для возбуждения этих наночастиц, можно использовать источник света, который стоит около 200 долларов, а не 200 000 долларов”.
Задача состоит в том, чтобы ввести наночастицы из лантаноидов в живые ткани, которые исследователи хотят изучить, такие как головной мозг. Поскольку эти наночастицы не растворимы, то они не могут быть безопасно введены в кровоток, так как они могут осесть на стенках кровеносных сосудов, в конечном итоге сформировать сгусток.
Другие группы ученых пытались добиться увеличения растворимости наночастиц, покрыв их гидрофильными или «влаголюбивыми» полимерами. Эти полимеры представляют собой вытянутые «нити» с «хвостом», который притягивается к воде и «головой», которая притягивается к наночастице. В теории, ожидалось, что «голова» будет связываться с поверхностью наночастицы, а «хвост» будет взаимодействовать с кровью, но, поскольку «нить» прикрепляется к частице только через одну единственную точку контакта, то такая связь легко разрушается. Создание большего количества контактов решает одну проблему, но создает другую.
“Такие «нити» хорошо приклеиваются к частице, но, к сожалению, не остается ни одной из его гидрофильных частей доступной для взаимодействия с растворителем, – сказал Виноградов. – В результате, растворимость наночастиц не становится лучше”.
Виноградов и его коллеги решили изменить подход, и взяли направление на создание дендритных полимеров. Эти дендримеры имеют несколько областей присоединенных к «ядру», образуя сферическую форму. «Представьте себе, у вас есть теннисный мяч, и вы прикрепляете его к стене покрытой липучкой. У этого мяча, значительная часть его поверхности, по-прежнему доступна для взаимодействия, – сказал Виноградов. – В нашем случае мы берем наночастицу лантаноида и покрываем всю ее поверхность гидрофильными «шариками». Это упрощенная картина происходящих процессов”.
Присоединение этих дендримеров к наночастицам стало возможным благодаря более ранним исследованиям Кристофера Мюррея.
Исследователи проверили эффективность этого подхода в опытах на мышах.
Сначала они использовали инъекции обычных красителей, в качестве маркеров, и использовали фемтосекундный лазер для отображения сосудистого участка мозга мыши. Затем они перешли на лазер, который был в миллион раз слабее и исследовали ту же области мозга снова, но, как и ожидалось, не получили флуоресценции. И, наконец, они, используя все тот же слабый лазер, ввели наночастицы покрытые дендримерами, и в результате смогли получить снимки участков мозга, аналогичные полученным изображениям при использовании мощного лазера.
«Это означает, что мы смогли получить результат без использования фемтосекундного лазера, а значит на сотни тысяч долларов дешевле», – сказал Виноградов. Этот эксперимент был первой демонстрацией использования наночастиц из лантаноидов в получении изображений нейронов, одновременно он является первым примером двухфотонной микроскопии использующей простой, недорогой лазер.
По данным – phys.org
